MALDI的单细胞质谱分析方法

       融智小编与你一起分享MALDI在单细胞分析中的应用。MALDI是目前生物组织成像研究最常用的离子化手段之一,但由于空间分辨率的限制,MALDI在单细胞分析中的应用一度遇到了瓶颈。

       近年来,随着技术手段的提高,MALDI的空间分辨率已经达到了单细胞水平,因而也开始被用于单细胞分析研究。

       伊瓦涅斯技术团队设计了一个微阵列样品板(用于质谱分析的微阵列,MAMS),该样品板上集成了高密度的“小孔”阵列,以实现高通量检测图13)。制备样品时,首先将细胞悬浮在低温缓冲液中,以中止细胞内的生化反应; 然后经过洗涤和离心,得到一定浓度的细胞悬浮液。将细胞悬浮液铺洒在MAMS样品板上,细胞便会分散到各个“小孔”中,每个“小孔”中所含有的细胞个数服从泊松分布。控制细胞悬浮液的浓度,便能间接地控制分散到“小孔”中的细胞个数。之后,通过喷雾的方式将辅助基质喷洒到MAMS表面,进行后续的MALDI检测。他们使用这项技术对酵母细胞的糖酵解代谢通路进行了研究,在培养基中加入糖酵解抑制剂2-脱氧 - D - 葡萄糖(2DG)来抑制酵母细胞的糖酵解过程。检测结果显示,酵母细胞中ATP与ADP含量的比值(ATP / ADP)呈现下降趋势。而敲除了pfk2基因(负责编码Pfk同工酶,影响磷酸果糖激酶的活性,敲除后的效果与加入2DG的效果类似)的酵母细胞中ATP / ADP比值也呈下降趋势。还将单细胞的检测结果同群体细胞的检测结果做了对比,发现二者的趋势一致。但是单细胞的检测结果具有明显的个体差异性,这是群体细胞的检测结果所无法展现的。

       借助MAMS对酵母细胞中ATP的合成代谢进行了研究。他们使用13 C 2标记的乙醇培养酵母细胞,随着培养时间的增加,酵母细胞中ATP分子的12 C原子逐渐被13 C原子取代,直到48 h以后,大部分12 C 10 -ATP分子都变成了13 C 10 -ATP。他们对比了单细胞的检测结果和群体细胞的检测结果,在培养了10 h后,单细胞中ATP分子所含的13 C原子个数呈现出较大的随机性,这体现了单细胞的个体差异性,而群体细胞的检测结果则没有这样的现象。这也反映了单细胞检测的意义。

       将MALDI与免疫细胞化学结合起来,建立了一套针对神经组织中特殊神经细胞个体的分析方法。由于个体差异性的存在,即使是同一片组织中的细胞在生理功能和物质组成上也可能会有明显差别。如何在多细胞的混合体系中找到目标细胞,并对其代谢物进行分析,是一个有待解决的问题。Neupert等首先对离体的活体组织进行酶解,使细胞分散开; 然后在载玻片上对细胞进行贴壁培养; 之后通过免疫细胞化学的方法对待测细胞进行显色,找到目标细胞; 最后通过MALDI对目标细胞中的代谢物进行检测。

              图13 立的基于MAMS的高通量单细胞分析方法

       以上几个工作都是直接对单细胞进行解吸附/离子化的。由于细胞本身处于离散状态,相互之间的距离大于MALDI激光光斑的尺寸,所以即使MALDI的空间分辨率没有达到单细胞水平,依然能避免不同细胞个体之间的相互干扰,实现单细胞检测。而在生物组织成像研究中,如果要实现单细胞水平的检测,就需要MALDI的空间分辨率切实达到单细胞水平了。拉加里格等[54]便做了这样的尝试,他们使用第二代智能激光源(smartbeam II激光)成功地将成像分辨率降低到了20微米。

       第二代智能激光源相对于常见的Nd:YAG(钕掺杂钇铝石榴石)激光源来说,光束更加均一(图14)。在光斑照射的区域内(图14(a)绿色区域),样品分子都能顺利地解吸附/离子化。而常见的Nd:YAG激光源是一种高斯激光源(高斯光束激光),其照射区域内有三个亚区,如图14(b)所示,绿色区域是最佳的解吸附/离子化区域; 中间的红色区域,激光能量过强,样品分子被迅速地剥蚀掉,最终对整体信号强度的贡献不大; 外围的灰色区域激光能量太弱。虽然这里的样品分子和基质分子都能被解吸附,但却不能实现样品分子的离子化。的Nd:YAG激光源所产生的信号强度随着光斑尺寸的减小而迅速降低。当光斑尺寸减小到10?50μm时,所能得到的信号强度已经不太理想了了,而第二代智能激光源在光斑尺寸减小到10微米时,对大鼠脑组织仍有可观的信号强度。Lagarrigue等在20μm的空间分辨率下对大鼠睾丸组织中精子的形成过程进行了单细胞水平的成像研究。他们的工作为生理学和病理学的研究提供了借鉴。

       另一种改善MALDI空间分辨率的方式。他们将待成像的生物组织铺展在一种可拉伸的膜上,然后对膜进行拉伸,生物组织在拉伸的过程中被撕裂成微米级别的碎片。通过扫描电子显微镜对拉伸后的生物组织样品进行观察可见,组织碎片均匀地散落在膜上。拉伸完成后,在样品上喷洒辅助基质进行正常的MALDI成像。他们用这种方法对大鼠脊髓组织进行了成像研究,结果显示,成像的空间分辨率提高了5倍(像素密度提高了25倍,图15),最高有效分辨率可达7.9微米。样品前处理时的拉伸过程相当于对生物组织进行了放大处理。齐默尔曼等也做了类似的工作。除此之外,近年来有关高分辨MALDI的报道还有很多。

图14 第二代智能激光源和常见的的Nd:YAG高斯激光源的解吸附/离子化性能对比

       利用MALDI对加州海兔神经细胞在受到促分泌素刺激后所释放的分泌物进行了检测。他们设计了一种毛细管,在毛细管内部填充有纳米硅球,硅球表面经过十八烷基修饰,能够富集神经细胞的分泌物。在这根毛细管的外部,还套有另一个毛细管。含有促分泌素的溶液经两个毛细管之间的空隙流至待测细胞周围,刺激待测细胞。之后,溶液由里面那根毛细管流出。神经细胞释放的分泌物便被富集在纳米硅球上了。最后经溶剂洗脱,由MALDI进行分泌物的检测。


       小编认为,质谱成像市场正呈上升态势,随着科研领域逐渐意识到质谱成像的重要性,开展一系列的科研,尤其在生命科学领域,质谱成像也将在多层次中有力地帮助科学家们获得更多的分子分布原位分析信息,而这些科研成果亦将逐渐转化为实际需求,惠及更广泛的应用。

       但当前处于少数企业垄断的市场,使得质谱成像设备价格居高不下,一台高端成像质谱的价格动辄近千万元。融智生物希望通过更亲民的价格,使这一技术能惠及广泛的应用层面。目前,QuanIMAGE产品已经上市,融智生物从科研领域开始,把它推向中国以及海外市场。

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