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2020.11.16

糖尿病是一组以高血糖为特征的代谢性疾病。长期以来,糖尿病的主要诊断依据是空腹血糖和口服葡萄糖耐量试验,现在这种状况已经改变。

2010年,美国糖尿病协会(ADA)糖尿病诊疗指南正式确定将HbA1c作为糖尿病诊断的一种指标,诊断临界值为≥6.5%;5.7%-6.4%归类为“糖尿病高危人群”。2011年,世界卫生组织(WHO)也建议在条件具备的国家和地区采用这一切点诊断糖尿病。目前,部分国家已将HbA1c作为筛查糖尿病高危人群和诊断糖尿病的重要指标。

什么是糖化血红蛋白?

糖化血红蛋白(HbA1c)是人体血液中葡萄糖与血红蛋白分子β链的N-末端缬氨酸残基以共价键结合的稳定化合物,全称为血红蛋白β链(血液)-N-(1-脱氧果糖-1-基)血红蛋白β链。糖基化过程只依赖于时间、葡萄糖浓度和血红蛋白水平。

与葡萄糖只能在一个时间点显示血糖水平不同,HbA1c可以反映过去8-12周的血糖水平,且HbA1c测试不需要禁食,其水平也不会受到压力、运动和吸烟的严重影响。由于其稳定性好,监测频率低,使得HbA1c成为国际公认的用于评估糖尿病患者长期血糖状况的理想指标。

糖化血红蛋白常见检测方法

目前市场上有数十种HbA1c检测方法,但是它们基本都是基于两种检测原理,即基于糖化和非糖化血红蛋白所带电荷不同进行分离,和基于糖化和非糖化血红蛋白结构不同进行分离。前一种原理用于离子交换色谱和电泳分析法,而后一种原理用于免疫分析、基于硼酸亲和层析的分析和酶法。

不同的方法原理各有优缺点,方法的选择将取决于临床和分析因素。通常情况下,变异血红蛋白及衍生血红蛋白主要干扰基于糖化与非糖化血红蛋白所带电荷不同的离子交换色谱法,包括离子交换高效液相色谱(HPLC)法。

不同HbA1c检测方法对比表

方法

原理

优势

缺点

酶法

使用位点特异的蛋白内切酶和糖化氨基酸氧化酶,检测反应吸光度

反应系统快速均一,仪器构造简单成本低

不能发现变异血红蛋白,原理存在局限性,适用血红蛋白浓度范围有限,应用较少

免疫法

血红蛋白糖基末端的4个氨基酸作为单克隆抗体识别位点

操作简便、快速,避免大部分异常血红蛋白的干扰

不能识别异常血红蛋白,CV高于离子交换法

亲和层析法

硼酸基团与糖化的血红蛋白可逆结合

受变异血红蛋白干扰小,研究中用作参比方法

不能发现变异血红蛋白,检测总糖化血红蛋白,HbA1c结果为计算值

POCT

亲和层析色谱、免疫法

高度自动化、简便、耗时短、无需实验室设备

精密度等性能指标不符合临床要求,行业标准不建议采用

毛细管电泳法

血红蛋白各组分带电荷不同

精密度高、敏感性高,受异常血红蛋白干扰程度低

设备成本高、检测速度等性能指标有待提高

离子交换-HPLC

血红蛋白各组分带电荷不同,通过阳离子交换树脂分离

操作方便、结果准确、快速,技术成熟,应用最广泛

受到异常血红蛋白和血红蛋白病的干扰

HPLC-MS

血红蛋白β链酶切纯化,定量检测

高特异性、高灵敏度,作为HbA1c检测的参考方法

耗时长、成本高、不适用于常规检测

 

质谱糖化血红蛋白检测新方法

(1)MALDI-TOF MS工作原理

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)是近年来发展起来的一种新型的软电离生物质谱,其无论是在理论上还是在设计上都是十分简单和高效的。它的工作原理是用激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜,基质从激光中吸收能量传递给生物分子,从而使生物分子电离,离子在电场作用下加速飞过飞行管道,根据到达检测器的飞行时间不同而被检测,即通过测定离子的质荷比(M/Z)与离子的飞行时间成正比来检测离子。MALDI-TOF MS具有灵敏度高、准确度高及分辨率高等特点,为生命科学等领域提供了一种强有力的分析测试手段,并正扮演着越来越重要的作用。

MALDI-TOF MS工作原理示意图


(2)MALDI-TOF MS检测HbA1c原理

血红蛋白分子结构

血红蛋白是红细胞内运输氧的特殊蛋白质,是使血液呈红色的蛋白,由珠蛋白和血红素组成,其珠蛋白部分是由两对不同的珠蛋白链(α链和β链)组成的四聚体。

与其他HbA1c检测系统不同,MALDI-TOF MS检测的是游离的珠蛋白链,而不是四聚体。其检测原理是体内非酶促糖化反应造成β珠蛋白链增加一个葡萄糖,使得糖化与非糖化β珠蛋白链分子量相差162Da,通过糖化β珠蛋白链/(β珠蛋白链+糖化β珠蛋白链)来计算其糖基化率。

糖化血红蛋白的MALDI-TOF MS谱图

(3)MALDI-TOF MS检测HbA1c优点

融智生物推出的QuanGHb糖化血红蛋白定量质谱系统,基于QuanTOF新一代宽谱定量飞行时间质谱(新一代的MALDI-TOF MS)平台,得益于其强大的分辨能力,能准确定量糖化血红蛋白(HbA1c)的同时,也可检测其他类型变异血红蛋白(hemoglobin variant),且抗干扰能力优异。

可定量:糖化血红蛋白定量检测,同时可检测变异血红蛋白(hemoglobin variant)

效率高:一次可达96、384等通量;一个样本30秒内即可完成检测

结果准:质谱准确检测,抗干扰能力强

成本低:测试成本低

(4)检测流程

【参考文献】

1.“Evaluation of MALDI-TOF MS for the measurement of glycated hemoglobin”, Clinica Chimica Acta 498 (2019) 154–160. 

2.“Detection of a novel hemoglobin variant Hb Liaoning by matrix assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry”,  March 2019, Clin. Chem. Lab. Med.

3.“Potential of MALDI-TOF mass spectrometry to overcome the interference of hemoglobin variants on HbA1c measurement”, doi.org/10.1515/cclm-2020-0724.

 

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