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QuanNUA 核酸分型质谱的 10 种鸭源性致病病毒的快速检测,方法特异性良好

QuanNUA 核酸分型质谱的 10 种鸭源性致病病毒的快速检测,方法特异性良好

仪器与试剂

目标鸭源性病原体包括 DHAV-1 分离株 C80(DQ864514)、DHAV-3 分离株 C-GY(EU352805)、DAstV-1 分离株 D17(MN149392)、DAstV-2 分离株 SL4 (KF753806)、DRV-1 分离株 815-12(KC508656)、DRV-2 分离株 091(JX478256)、 TMUV 分离物 PS(KT876991)、GPV 分离物 JS1(KT935531)和 DEV 来自中国 农业大学兽医学院。AIV 亚型 H9N2(GQ373128)由中国农业大学禽流感实验室 提供。所有这些病毒在检测前均经 RT-PCR/PCR 鉴定。非靶标鸭源性病原菌包括 大肠杆菌、沙门氏菌和鸭疫里默氏菌,均来自中国农业大学兽医学院。2.5×PCR mix、质量探针试剂盒,以及 QuanTOF 质谱仪及 QuanNUA 软件,均来自于融智 生物科技(青岛)有限公司

实验方法

分别下载 10 种病毒的基因组序列,针对选定的靶基因,设计质粒构建用引物和检测用引物,分别构建了标准 质粒,建立检测方法,并确定检测方法的特异性;对标准质粒进行 10 倍系列稀释,确定该方法的敏感性。利用该 检测方法对人工制备的混合感染样品进行检测,与普通 PCR 检测结果进行比对。 结果与讨论 结果显示,本研究所建立的检测方法可同时检测到包括鸭甲肝病毒 1 型、鸭甲肝病毒 3 型、鸭星状病毒 1 型、 鸭星状病毒 2 型、鸭呼肠孤病毒 1 型、鸭呼肠孤病毒 2 型、坦布苏病毒、禽流感病毒、小鹅瘟病毒和鸭病毒性肠 炎病毒等 10 种病毒和 1 种内参基因,且 10 种病毒之间的检测结果互不干扰;对 10 倍系列稀释的标准质粒进行检测, 当稀释度为 10-10 时仍能检测到核酸,针对不同病毒的标准质粒最低检出量为 1.3~7.8 × 100 copies,对混合样 品的检测结果与普通 PCR 结果一致。

研究人员用已知含有特定病毒的临床样品模拟了四种混合感染,对该方法进行了评价。如预期的那样,在所 有的样本中,都能准确地识别出目的病毒,包括 RNA 和 DNA 病毒。

结果

综 上 所 述, 本 研 究 建 立 的 基 于 QuanNUA 核酸分型质谱的 10 种鸭源性致病病毒的快速检 测,方法特异性良好,与普通 PCR 相比,基于 QuanNUA 核酸分型质谱的检测方法的灵敏度大大 提高,并可对同一样品进行多种病毒的检测,使整 体检测成本下降,不同病毒之间的检测结果互不干 扰,可为鸭病毒病病原的快速诊断和分子流行病毒 学调查提供极大便利。基于核酸质谱的检测方法, 可实现对无法以核糖体蛋白作为生物标志物的微生 物进行检测,使 MALDI-TOF MS 有望成为对此类 微生物进行快速、高灵敏分型鉴定的新的有效工 具,具有一定的应用推广潜力。

参考文献

Establishment of a simultaneous detection method for ten duck viruses using MALDI-TOF mass spectrometry. Ning Liua,Lei Wanga,Gaozhe Caib,et al. [J].Journal of Virological Methods, 273 (2019) 113723.

 

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